I det siste spillet i den opprinnelige Sonic-historien, fortsetter vi hvor Sonic the Hedgehog 3 slapp. Eksplosjonen fra the Death Egg sender han flaksende til Mushroom Hills hvor han må stoppe Dr. Robotnik fra å få tak i Master Emeralden som befinner seg et eller annet sted på øya. Denne gangen får vi spille Knuckles for første gang, en rival fra det forrige spillet som nå har sin egen agenda for hevn. De to må kjempe sammen for å ta ned Dr. Robotnik en gang for alle i hva som anses av mange som seriens høydepunkt.

Sonic & Knuckles var det første spillet som hadde såkalt "Lock On"-mulighet - altså å koble sammen andre Sonic-spill for å utvide dem. Kobler man f.eks sammen Sonic the Hedgehog 2 får du spille Knuckles der, og med Sonic the Hedgehog 3 får du blant annet muligheten å spille som Tails og nyte Sonic the Hedgehog 3 og Sonic & Knuckles sammen som ett langt spill.